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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1614 (2023) Diesen Artikel zitieren
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Details zu den Metriken
Kabelbakterien sind zentimeterlange filamentöse Bakterien, die Elektronen über interne Drähte leiten und so die Sulfidoxidation in tieferen, anoxischen Sedimenten mit der Sauerstoffreduktion im Oberflächensediment koppeln. Diese Aktivität führt zu geochemischen Veränderungen im Sediment, und andere Bakteriengruppen scheinen von der elektrischen Verbindung mit Sauerstoff zu profitieren. Hier berichten wir, dass verschiedene Bakterien in einem dichten Schwarm um den anoxischen Teil der Sauerstoff atmenden Kabelbakterien schwimmen und sich sofort zerstreuen, wenn die Verbindung zum Sauerstoff unterbrochen wird (durch Schneiden der Kabelbakterien mit einem Laser). Die Raman-Mikroskopie zeigt, dass Flockenbakterien stärker oxidiert werden, wenn sie sich näher an den Kabelbakterien befinden. Der physische Kontakt scheint jedoch selten und kurz zu sein, was auf eine mögliche Übertragung von Elektronen über nicht identifizierte lösliche Zwischenprodukte hindeutet. Die metagenomische Analyse weist darauf hin, dass es sich bei den meisten Schwarmbakterien offenbar um Aerobier handelt, darunter Organotrophe, Sulfidoxidationsmittel und möglicherweise Eisenoxidationsmittel, die Elektronen zur Atmung auf Kabelbakterien übertragen könnten. Die Assoziation und enge Interaktion mit so unterschiedlichen Partnern könnte erklären, wie Sauerstoff über Kabelbakterien mikrobielle Gemeinschaften und Prozesse bis weit in anoxische Umgebungen hinein beeinflussen kann.
Kabelbakterien sind lange filamentöse Bakterien, die Elektronen über Zentimeterentfernungen übertragen und so die Oxidation von Sulfid mit der Fernreduktion von Sauerstoff oder Nitrat koppeln können1,2. Sie kommen weltweit in Meeres- und Süßwassersedimenten und Grundwasserleitern vor3,4,5 und beeinträchtigen direkt den Schwefel-, Sauerstoff-, Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf6. Über pH-Gradienten und elektrische Felder, die durch ihre Elektronenverlagerung induziert werden, beeinflussen sie indirekt auch den Eisen-, Kalzium-, Kobalt- und Arsenkreislauf sowie alle Ionenflüsse in ihren Lebensräumen6,7,8,9. In Süßwassersedimenten können sie eine 4,5-fache Stimulation der Sulfatreduktion und eine drastisch geringere Methanemission bewirken10,11.
Die Aktivität von Kabelbakterien wurde auch mit einer verstärkten Kohlenstoffassimilation autotropher Sulfidoxidationsmittel in Verbindung gebracht12 und korrelierte mit der Verteilung eisenzyklierender Bakterien in Meeressedimenten13. Diese offensichtlichen Zusammenhänge haben zu Spekulationen geführt, dass Bakterien in anoxischen Sedimenten Kabelbakterien irgendwie als Elektronenleiter für Sauerstoff nutzen könnten14,15.
Hier verwenden wir eine Kombination aus mikroskopischen Beobachtungen, Metagenomsequenzierung, Lasermikrodissektion und Raman-Mikroskopie, um die Dynamik und Intimität dieser Assoziation zu demonstrieren, die beteiligten Bakterien vorläufig zu identifizieren und einen wahrscheinlichen Mechanismus für den Elektronentransfer zwischen assoziierten Bakterienschwärmen und Kabelbakterienfilamenten vorzuschlagen .
Kabelbakterien aus einer Anreicherung des Süßwasserstammes Ca. Electronema aureum GS16 wurden unter naturnahen Bedingungen auf einem Objektträger (einem sogenannten Grabenobjektträger) beobachtet, wo Sauerstoff vom Rand des Deckglases eindiffundierte, während organisches Material, Sulfid und andere Nährstoffe aus dem Sediment in einem zentralen Objekt bereitgestellt wurden Fach (Graben)17,18. Dieser Aufbau etablierte eine Beobachtungszone, in der sich Kabelbakterien vom Sediment bis zur oxisch-anoxischen Grenzfläche erstreckten, die klar durch einen mikroaerophilen Schleier aus beweglichen, aeroben Bakterien abgegrenzt war (Abb. S1). Im anoxischen Teil der Zone, bis zu 4 mm von der oxisch-anoxischen Grenzfläche entfernt, wurde festgestellt, dass Bakterienzellen in einem Schwarm um Kabelbakteriensegmente schwimmen und im Allgemeinen 2,2:1 zahlreicher sind als benachbarte Kabelbakterienzellen (Abb. 1A, Film). S1, Tabelle S1). Eine detaillierte Zellverfolgung zeigte chemotaktisches Verhalten gegenüber den Kabelbakterien: Die Schwarmzellen konzentrierten sich in der Nähe der Kabelbakterienfilamente, wobei die höchsten Zelldichten in einem Abstand von 20 µm auftraten, die Dichten jedoch immer noch bis zu einer Entfernung von mindestens 50 µm anstiegen (Abb. 1B, Abb . S2). Es gab kein offensichtliches Muster dafür, dass die Scharbakterien Kabelbakterien berührten, aber da die Auflösungsbeschränkungen herkömmlicher Lichtmikroskope und die dynamische Natur der Wechselwirkung Methoden mit höherer Auflösung abschrecken, können wir derzeit nicht ausschließen, dass es zu Berührungen kommen könnte; aber wenn ja, dann war es selten und kurz. Die Schwimmgeschwindigkeit der Schwarmbakterien war innerhalb einer Entfernung von 20 µm deutlich erhöht (Abb. 1C), was auf eine erhöhte Protonenantriebskraft hinweist19,20,21. Der Anteil der Bakterienzellen, die durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in einem Abstand von 10 µm von Kabelbakterien nachweisbar waren, war signifikant höher als in einem Abstand von >10 µm (Tabelle S2), was darauf hindeutet, dass sie im Vergleich zur Masse eine höhere Ribosomenzahl und damit eine höhere Stoffwechselaktivität aufwiesen Sedimentbakterien22. Zusammengenommen deutet dies auf hohe Stoffwechselraten innerhalb der Herde und eine Stoffwechselstimulation der Schwarmbakterien hin, wenn sie den Kabelbakterien sehr nahe kommen.
Ein Flockbakterium, das von einem Kabelbakterienfilament angezogen wird (Mitte) (Maßstabsbalken, 10 µm). B Zählungen schwimmender Bakterien in unterschiedlichen Abständen zum Kabelbakterienfilament (960.071 Zählungen von 3211 Schwarmbakterien in 12 Videobildern, mittlerer Abstand 17,42 µm. Die Mittelwerte der einzelnen Proben lagen zwischen 4,96 und 24,58 µm. C Unterschied in der mittleren Schwimmgeschwindigkeit von Bakterienzellen im Verhältnis zu ihrem Abstand zum Filament des Kabelbakteriums. Der blau schattierte Bereich entspricht einem Abstand innerhalb von 20 µm von einem Kabelbakterium, der grün schattierte Bereich entspricht mehr als 20 µm. Welchs Zwei-Stichproben-t-Test (zweiseitig) zeigt dies Die Schwimmgeschwindigkeit der Zellen unterscheidet sich deutlich zwischen diesen beiden Distanzgruppen (angezeigt durch *); p-Wert = 2,2e−16 (Nsamples = 11, Ncells = 2712). D Dichtediagramm der Bakterienzellgrößen aus allen Proben (n = 12), was zeigt, dass die Mehrheit der interagierenden Zellen klein ist. E Phasenkontrastbilder der verschiedenen gefundenen Zellmorphologien. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.
Schwärme schwimmender Bakterien wurden in unserem Versuchsaufbau häufig beobachtet, nämlich auf 17 von 21 Kabelbakterien in Kontakt mit Sauerstoff; Im Gegensatz dazu wurden bei Kabelbakterien, die nicht mit Sauerstoff in Kontakt kamen, nie Schwärme beobachtet, was eine Abhängigkeit der Chemotaxis von einer Hochpotential-Elektronensenke in den Kabelbakterien unterstützt18. Dies wurde eindrucksvoll durch die schnelle Reaktion der Bakterienschwärme bestätigt, als sie den Kabelfaden mit einem Laser in zwei Teile schnitten (Abb. 2): Die Schwärme um den Teil, der jetzt von seiner elektrischen Verbindung zum Sauerstoff getrennt war, hörten innerhalb von 13 ± 2 s auf (Tabelle S3). ). Als ein Kabelbakterienfilament mitten in einem Bakterienschwarm durchtrennt wurde, war die Reaktion noch deutlicher. Die Flockenbakterien verteilten sich sofort von dem Teil des Filaments, der nicht mehr mit Sauerstoff verbunden war, wurden aber immer noch um den Teil herum beobachtet, der noch immer mit Sauerstoff verbunden war (Film S2). Diese sofortige Reaktion deutet darauf hin, dass die Herdenbakterien von einem Zustand angezogen werden, der ausschließlich von Kabelbakterien erzeugt wird, während sie Elektronen zu Sauerstoff leiten, und nicht beispielsweise von extrazellulären Polymeren, die im Rahmen ihrer Beweglichkeit ausgeschieden werden17.
Eine schematische Darstellung. Ein auf der rechten Seite mit Sauerstoff verbundenes Kabelbakterium wird mit einem Laser-Mikrodissektionsmikroskop in der Nähe der oxisch-anoxischen Grenzfläche geschnitten. B Ergebnis. Bakterienspuren auf dem suboxischen Teil eines Kabelbakteriums, generiert aus einem Video vor und nach einem Schnitt. Rote Linien sind Spuren schwimmender Bakterien und schwarze Linien und Punkte geben die Position des Kabelbakteriums alle 50 Bilder an. Das Kabelbakterium bewegt sich nach dem Schnitt weiter, als ob das Filament seine Sauerstoff-Chemotaxis beginnen würde (Maßstabsbalken, 10 µm). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.
Die mit den Süßwasserkabelbakterien interagierenden Bakterien waren morphologisch sehr vielfältig. Bei der Mehrzahl handelte es sich um stäbchenförmige, vibrioide oder eiförmige Zellen mit einer Größe von 1–2 µm (Längsachse), aber es wurden auch einige deutlich größere Zelltypen erfasst, darunter gerade Stäbchen, gebogene Stäbchen und spirochetenartige Zellen (Abb. 1D, E, Abb. S3). Um Einblicke in die wahrscheinliche Identität und Stoffwechselvielfalt der Bakterien zu erhalten, die die Herden bilden, haben wir 27 qualitativ hochwertige Genome (Abb. 3, Ergänzungsdatensätze 1–3) aus einem Metagenom zusammengestellt, das durch Probenahme der Kabelbakterien-Beobachtungszone eines von ihnen erstellt wurde die Objektträger (Abb. S1). Wir identifizierten 25 Gattungen aus 6 Phyla, die basierend auf der Annotation des Genoms und dem Vergleich mit ihren nächsten Verwandten vier wichtige einheitliche Merkmale aufwiesen: Motilität, Chemotaxis, Organotrophie und Atmung (mit Sauerstoff/Nitrat/Nitrit) (Abb. 3). Darüber hinaus waren Sulfidoxidation und Autotrophie häufig, während Sulfat- oder Eisenreduktion und Eisenoxidation selten waren; Methanoxidation wurde nie identifiziert. Diese Daten stimmen mit einem Szenario überein, in dem die Flockenbakterien organische Verbindungen, Sulfid und möglicherweise Fe2+ oxidieren können, indem sie Elektronen an Kabelbakterien abgeben, d. h. sie atmen über Kabelbakterien. Während einige der extrahierten Genome Gene für den extrazellulären Elektronentransfer (EET) aufweisen und einige der nächsten Verwandten dieser Bakterien ebenfalls EET-Fähigkeiten aufweisen (Abb. 3), gibt es kein klares und konsistentes Muster für einen bekannten EET-Mechanismus.
Die Daten wurden aus der Annotation von Metagenom-assemblierten Genomen und aus Literaturrecherchen abgeleitet. EET, extrazellulärer Elektronentransfer. Quelldaten werden in den Ergänzungsdatensätzen 1–3 bereitgestellt.
Elektronen können zwischen prokaryotischen Zellen durch direkten Kontakt, durch Übertragung durch Protein-Nanodrähte oder leitfähige Materialien oder vermittelt durch lösliche Elektronen-Shuttles ausgetauscht werden23. Das offensichtliche chemotaktische Verhalten mit ständigem Schwimmen und keinem Stop-and-Touch-Verhalten, wie es bei einigen Elektronenübertragungen auf Mineralien beobachtet wird24, lässt darauf schließen, dass der Elektronentransfer zwischen den Spezies (IET) von Schwarmbakterien zu Kabelbakterien durch Gradienten löslicher Zwischenprodukte vermittelt wird. Dies wurde weiter durch Beobachtungen von Redoxzuständen zellulärer Cytochrome mit Raman-Mikroskopie gestützt18; Zellen der Flockenbakterien, die mit einer Laserpinzette eingefangen und bewegt wurden, waren deutlich stärker oxidiert, wenn sie näher als 5 µm an das Kabelbakterium herankamen, und stärker reduziert, wenn sie mehr als 50 µm entfernt waren (Abb. 4, Abb. S4). Die gleiche signifikante Veränderung wurde bei Zellen beobachtet, die aus einer Kultur von Acidovorax facilis DSM649, einem kultivierten Vertreter eines der am häufigsten vorkommenden Mitglieder der assoziierten Bakteriengemeinschaft, in die Objektträger eingeführt wurden (Abb. 3; 96,03 % durchschnittliche Nukleotididentität (ANI) zum Genom). bin GS.4 in dieser Studie wiederhergestellt); Der Cytochrom-Redoxzustand änderte sich in Kontrollzellen, die zufällig mit der Laserpinzette bewegt wurden, nicht (Abb. S5).
Eine schematische Darstellung des Experiments. Eine Flockzelle wird eingefangen und direkt neben einem Kabelbakterienfilament bewegt, mit Raman-Mikroskopie gemessen, dann ca. 50–100 µm entfernt bewegt und nach ca. 3 s erneut gemessen. B Die Änderung der normalisierten Intensität der 750-cm-1-Bande für jede einzelne Zelle, wenn sie neben das Kabelbakterium und von diesem weg bewegt wird. Die 750-cm-1-Bande weist auf den Redoxzustand des Cytochroms hin, mit hohen Werten für reduzierte und niedrigen Werten für oxidierte Cytochrome. Die Bandenintensitäten und damit die Cytochrom-Redoxzustände unterscheiden sich deutlich zwischen den beiden Positionen (native Zellen = 5, p-Wert = 0,015, angezeigt durch *; NA.facilis = 8, p-Wert = 0,0387 angezeigt durch **, zwei- seitiger t-Test für abhängige Stichproben); au, beliebige Einheiten. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.
Wir schätzen, dass Shuttle-Konzentrationen im nM-Bereich ausreichen, um die Atmung des Bakterienschwarms zu unterstützen (Ergänzende Anmerkung 1, Tabelle S4). Da aquatische Sedimente hochpotente Shuttle-Verbindungen enthalten können, die diese Konzentration überschreiten (z. B. >1 mg ml-1 Huminsäuren in Seesedimenten25 oder Flavine im nM-Bereich in Meeressedimenten26), müssen Shuttles nicht von Kabelbakterien produziert oder damit verbunden sein Bakterien. Außerdem würde die Umsatzrate eines löslichen Mediators in diesem Konzentrationsbereich unter 2 s liegen (Ergänzende Anmerkung 1, Tabelle S4). Dieser schnelle Umsatz deutet auf eine sofortige Erschöpfung des oxidierten Mediators hin, sobald die Kabelbakterien aufhören, seine reduzierte Form erneut zu oxidieren, und erklärt somit die schnelle Ausbreitung des Bakterienschwarms beim Unterbrechen der Verbindung des Filaments mit Sauerstoff. Dass Kabelbakterien einen starken Shuttle für oxidierte Elektronen bereitstellen, scheint die einzig plausible Erklärung für die Vermehrung anderer mit Kabelbakterien assoziierter Bakterien im anoxischen Sedimentkompartiment zu sein12,13, die Menge und Stärke der beweglichen Zellen, die Kabelbakterien umgeben (Abb. 1A, Film S1) und ihre schnelle Ausbreitung nach dem Schneiden (Film S2).
Auf der Seite der Kabelbakterien wurden keine bekannten EET-Fähigkeiten in den Genomen von Kabelbakterien identifiziert27, dennoch konnten intakte Kabelbakterien erfolgreich mit Elektroden verbunden werden28, was es wahrscheinlich macht, dass ein unbeschriebener Elektronenkanal in der Außenmembran existiert, der Elektronen von einem Shuttle empfangen kann28 .
Kabelbakterien, die eine Vielzahl anderer Bakterien im Sediment anziehen und eng mit ihnen interagieren, sind ein weiterer überraschender Befund im Zusammenhang mit den elektrischen Strömen, die zunächst aus geochemischen Anomalien abgeleitet und später nicht leitfähigen Mineralien oder Nanodrähten, sondern lebenden Drähten in Form zentimeterlanger Drähte zugeschrieben wurden Kabelbakterien1,29. Nun stellt sich eine Reihe neuer und interessanter Fragen für die zukünftige Forschung: Wie weit verbreitet und wichtig sind diese Wechselwirkungen vor Ort? Welche spezifischen Moleküle vermitteln die Wechselwirkungen und wie und wo werden sie in den Zellen auf beiden Seiten verarbeitet? Wie viel des Stroms in einem Kabelbakterium entsteht durch die Bakterienschwärme um ihn herum, und welchen Anteil kann der Schwarm an der Energie gewinnen, die von den primären Oxidationsprozessen bis zur abschließenden Sauerstoffreduktion erhalten bleibt? Ist die Wechselwirkung für das Kabelbakterium vorteilhaft oder schädlich und wird sie in irgendeiner Weise kontrolliert? Gibt es schwerer zu beobachtende Wechselwirkungen mit anderen, nicht beweglichen Zellen in der natürlichen Sedimentumgebung, und wie sieht die gesamte Palette mikrobieller Prozesse aus, die durch die elektrische Verknüpfung zu Sauerstoff durch Kabelbakterien stimuliert werden?
Alle Experimente wurden mit einer Süßwassersedimentanreicherungskultur von Ca durchgeführt. Electronema aureum GS, enthält eine einzelne Kabelbakterienart und viele einheimische und mit Kabelbakterien assoziierte Süßwassersedimentbakterien16. Diese Anreicherung wurde durch die Wärmebehandlung von Teichsedimenten, die auf dem Campus der Universität Aarhus in Dänemark gesammelt wurden, und deren Beimpfung mit einem einzelnen Kabelbakterienfilament erreicht. Die resultierende klonale Kabelbakterienanreicherung wurde in unserem Labor über mehr als 7 Jahre hinweg aufrechterhalten und übertragen.
Für das Mikroskopvideo, Manipulationsexperimente und die Raman-Mikroskopie wurden maßgeschneiderte Glasobjektträgerkammern17 konstruiert: Glasplatten wurden auf einen Mikroskopobjektträger geklebt, so dass in der Mitte ein Graben entstand, der mit Sedimenten aus dem Ca gefüllt wurde. Electronema aureum GS-Anreicherungskultur und mit N2-gespültem Leitungswasser und einem Deckglas bedeckt, wodurch ein Raum von 60 × 22 mm entstand, von dem 40 × 12 mm vom Graben eingenommen wurden, mit einem Abstand zwischen Deckglas und Objektträger von etwa 150– 200 µm (Abb. S1).
Die Objektträger wurden 2–24 Stunden lang in einer feuchten Umgebung inkubiert und dann auf einem AxioObserver-Mikroskop (Zeiss, Deutschland) untersucht, das mit einem motorisierten Tisch ausgestattet war.
Die meisten Aufnahmen und Beobachtungen wurden bei 100-facher Vergrößerung mit Dunkelfeldbeleuchtung gemacht, aber für Tracking- und Verteilungsdaten wurden Videos mit hoher Bildrate bei 400-facher Vergrößerung im Phasenkontrast aufgenommen, wobei die Bilder im Abstand von 88 oder 38 ms aufgenommen wurden. Für die anschließende Analyse wurden nur Videos ausreichender Qualität und Länge mit einem einzelnen Kabelbakterium und ohne größere Sedimentpartikel verwendet.
Um die Zellbewegung (Schwimmen) innerhalb der Bakterienschwärme um Kabelbakterien herum zu quantifizieren, wurden die aufgezeichneten Videos in Fidschi analysiert30. Um den Hintergrund und sich nicht bewegende Objekte zu entfernen, wurde der mittlere Pixelwert für den gesamten Bildstapel subtrahiert, so dass nur Ausreißer, d ein binäres Bild. Der Schwellenwert für diese Konvertierung und die Werte für „Kontrast verbessern“ wurden für jedes Video angepasst, um die Kabelbakterien und -zellen zu markieren, ohne dass Artefakte größer als 2 µm um das Kabel herum entstehen. Um eine Analyse der beweglichen Zellen relativ zum Kabelbakterienfilament zu ermöglichen, wurde die Position des Kabelbakterienfilaments in jedem 50. Bild manuell markiert, indem mit Fijis Werkzeug „Segmentierte Linie messen“ entlang gemessen wurde. Danach wurde das Fidschi-Plugin Mtrack2 verwendet, um die Position jeder Zelle im Schwarm in jedem Bild jedes Videos zu zählen und aufzuzeichnen. Manuelle Tracks wurden mit dem Fiji-Plugin MtrackJ31 einer kleinen Teilmenge von Zellen erstellt. Große Bakterienschwärme und Zellen vom Spirochätentyp mussten manuell verfolgt werden, da die ständige Formänderung und die Bewegung in den bzw. aus dem Fokus die automatische Verfolgung unzuverlässig machten. Die Videos wurden mit dem Ziel analysiert, Daten über die Entfernung jeder Schwarmzelle zum Kabelbakterienfilament, ihre Größe und Geschwindigkeit zu sammeln und schließlich ihre Bewegungen zu verfolgen. Die Einstellungen in Mtrack2 wurden bewusst breit eingestellt, da es viele unterschiedliche Größen und Geschwindigkeiten der Flockenzellen gab (Abb. 1, Abb. S3). Um eine Zählung der Zellen und eine Schätzung ihrer morphologischen Diversität zu erhalten, wurden die Zellzählungen einige Frames lang manuell durchgeführt. Anschließend wurde Fijis Tool „Partikel analysieren“ verwendet, um zellgroße Objekte mit einem Durchmesser zwischen 0,4 und 12 µm und einer Zirkularität von zu identifizieren 0,1–0,8. Diese Zahlen repräsentieren wahrscheinlich zu wenig die Anzahl der Zellen in der Nähe des Kabelbakteriums, da Zellen und Spuren aufgrund des Schattens des Filaments und der Lichtartefakte, die es bei der Phasenkontrastbildgebung erzeugt, verloren gingen, wenn sie sich auf oder in der Nähe des Kabelbakteriums befanden. Bilder mit schnellen Bewegungen des Kabelbakteriumfilaments17 oder Teilen des Kabelbakteriums außerhalb des Fokus wurden von der endgültigen Analyse ausgeschlossen.
Alle Verfolgungs- und Größenergebnisse der Flockenbakterien und Kabelbakterien wurden im CSV-Format gespeichert und dann einer weiteren Filterung und Analyse in R unterzogen. Zum Filtern der Spuren wurde ein benutzerdefiniertes Skript verwendet. Um Artefakte zu beseitigen, bei denen die Verfolgung fälschlicherweise von einer Zelle zur anderen gesprungen war, wurden die Spuren unterbrochen, wenn Zellen plötzlich ihre Durchschnittsgeschwindigkeit änderten. Partikel und Zellen, die durch die Brownsche Bewegung bewegt werden, würden in Mtrack2 Spuren erzeugen, ebenso wie an der Glasoberfläche haftende Zellen. Um diese ungültigen Spuren zu entfernen, wurden alle Spuren entfernt, die nicht mehr als 50 Pixel auf der x- oder y-Achse umfassten, und nur Spuren, die länger als 10 s dauerten, wurden für die weitere Analyse aufbewahrt. Daten zum Verhalten der verfolgten Zellen wurden mithilfe eines benutzerdefinierten R-Skripts generiert, das die Geschwindigkeit einer verfolgten Zelle, ihre zurückgelegte Distanz und ihre Entfernung zum nächstgelegenen Kabelbakterium berechnete.
Um sicherzustellen, dass bei der Analyse der Zellmorphologie nur Schwarmzellen verwendet wurden, die von Kabelbakterien angezogen wurden und um sie herumschwimmten, wurden die Koordinaten jeder Spur mit den Größendaten verglichen und alle Größenmessungen für diese Spur wurden gemeldet. Der Mittelwert der Neben- und Hauptachse dieser Zellen wurde berechnet. Spuren, bei denen die Größe um mehr als 20 % unterschied, wurden entfernt, um Artefakte zu vermeiden. Ein Diagramm verfolgter Zellen wurde manuell überprüft und alle offensichtlichen Artefakte, wie Schatten von Kabelbakterien oder unscharfe Elemente, wurden vor der weiteren Analyse entfernt.
Objektträgerkammern aus Glas mit Kabelbakterien und Bakterienherden wurden 3 Tage lang inkubiert, dann 90 Minuten lang bei 46 °C getrocknet, wonach das Deckglas entfernt wurde. Die Probe wurde durch sanftes Fluten mit einer abgestuften Ethanolreihe (50 %, 75 %, 96 % Ethanol, jeweils 3 Minuten) dehydriert. Anschließend wurde mit einem PAP-Stift (Rockland Immunochemicals Inc. Limerick, PA, USA) ein Kreis um den interessierenden Bereich gezogen, um die Lösungen während des FISH einzuschließen. Die Hybridisierung mit Cy3-markierten Sonden EUB338 I-III (5′-GCWGCCWCCCGTAGGWGT-3′; bestellt bei biomers.net), die auf fast alle Bakterien abzielte, wurde 90 Minuten lang bei 46 °C unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt32. Der Hybridisierungspuffer enthielt 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 35 % Formamid und 0,01 % SDS. Der Waschschritt wurde wie folgt modifiziert, um eine Störung der Probe zu vermeiden: Der Objektträger wurde auf eine vorgewärmte Platte (50 °C) gelegt, der Hybridisierungspuffer wurde schnell durch Pipettieren und Abtupfen von Papier entfernt, der Objektträger wurde dann mit vorgewärmtem Material abgedeckt Waschpuffer (80 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,01 % SDS), der wiederum durch Pipettieren und Papiertupfen entfernt wurde; dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. Abschließend wurde der Objektträger luftgetrocknet, mit 1 µg ml−1 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in Vectashield-Citifluor (4:1) bedeckt und auf einem Epifluoreszenzmikroskop (Axiovert 200 M) analysiert , Zeiss). Als Grenze für die Bewertung der Mitglieder der Bakterienschwärme wurde ein konservativer Schwellenwert von 10 µm Abstand zum Kabelbakterienfilament verwendet, um zu vermeiden, dass Zellen einbezogen werden, die möglicherweise durch die Waschschritte bewegt wurden.
Das Laserschneiden von Kabelbakterien, die von Schwärmen schwimmender Bakterien umgeben waren, wurde mit einem Laser-Mikrodissektionsmikroskop (LMD 7000, Leica, Deutschland) durchgeführt. Die Bakterienschwärme konnten bei 400-facher Vergrößerung visuell beobachtet werden, waren jedoch im Kamerasystem des LMD nicht leicht zu erkennen. Daher wurde die Bildgebung durch Umschalten zwischen dem LMD und einem AxioObserver (Zeiss)-Mikroskop mit Phasenkontrast durchgeführt. Da die Ausbreitung der Schwärme nach dem Durchtrennen des Kabelbakteriums jedoch ein schneller Vorgang war, wurde die Ausbreitungszeit mit einer Stoppuhr beim Blick durch das Okular aufgezeichnet. Die Ausbreitungszeit wurde als die Zeitspanne definiert, bis innerhalb von 15 µm des Filaments keine beweglichen Bakterien mehr beobachtet wurden, was dem beobachtbaren Bereich um das Kabelbakterienfilament im LMD entsprach. Es wurden nur Kabelbakterien verwendet, die vom oxisch-anoxischen Schleier bis in den Bereich der Herde zurückverfolgt werden konnten, ohne sich in anderen Filamenten zu verfangen. Für die Videoaufzeichnung wurde die Position der Flockbakterien am AxioObserver-Mikroskop erfasst und auf der Rückseite des Objektträgers mit einem Marker markiert. Anschließend wurde der Objektträger zum LMD übertragen, das Filament mit dem Laser geschnitten und der Objektträger sofort zurück zum AxioObserver-Mikroskop übertragen. Vor und nach dem Schnitt wurden 1 Minute lang Videos aufgezeichnet. Die durchschnittliche Transferzeit, einschließlich der erneuten Ermittlung der Position der sich ansiedelnden Bakterien, betrug <1 Minute.
Ein Metagenom wurde aus den gepoolten Lesevorgängen von fünf in Kjeldsen et al.27 beschriebenen Metagenomik-Sequenzbibliotheken rekonstruiert. Das Metagenom wurde mit MetaBat Version 0.25.4 mit dem Parameter –superpecifische33 gruppiert. Abdeckungsdateien für die differenzielle Abdeckungsanalyse wurden generiert, indem die Lesevorgänge aus den fünf Sequenzbibliotheken mithilfe von BBMap Version 35.82 mit einem minimalen Sequenzidentitätsschwellenwert von 98 % auf das Metagenom abgebildet und mit SAMtools Version 1.934,35 in das BAM-Dateiformat konvertiert wurden.
Um potenzielle mit Kabelbakterien assoziierte Mikroben zu identifizieren, wurden die Lesevorgänge aus einer Sequenzbibliothek verwendet, die aus einer Objektträgerkammer aus Glas stammte. Wie in Kjeldsen et al.27 beschrieben, wurde diese Bibliothek mit einer Sedimentanreicherung von Ca erhalten. Electronema aureum GS wurde einer Objektträgerkammer aus Glas hinzugefügt (Abb. S1). Die Kabelbakterien und damit verbundenen Bakterien, die sich aus dem Sediment in Richtung der oxisch-anoxischen Grenzfläche bewegt und sich in der transparenten Zone etabliert hatten, wurden auf einer mit Trockeneis gekühlten Aluminiumplatte schockgefroren und nach dem Abheben mit einer sterilen Rasierklinge abgekratzt das Deckglas (Abb. S1). Die DNA wurde mit dem PowerLyser® DNA Isolation Kit (MoBio Inc.) extrahiert. Bibliotheken für die metagenomische Sequenzierung der extrahierten DNA wurden mit dem Nextera DNA Library Prepared Kit (Illumina) erstellt und mit dem Illumina MiSeq Kit v3 sequenziert. Die Lesevorgänge wurden mit FastQC36 Version 0.11.4 qualitätsgeprüft und mit Trimmomatic v. 0.3337 getrimmt. Lesevorgänge aus dieser Sequenzierungsbibliothek wurden mithilfe von BBMap34 wieder den Bins zugeordnet. Behälter, deren Gerüste zu mehr als 70 % mit Lesevorgängen aus dieser Bibliothek bedeckt waren, wurden als assoziierte Kabelbakterien betrachtet. Vollständigkeit und Kontamination dieser Genom-Bins wurden mit CheckM Version 1.1.3 bewertet, wobei der Abstammungs-Workflow auf „Bakterien“38 eingestellt war. Für die weitere Analyse wurden Genome verwendet, die zu mehr als 70 % vollständig waren und weniger als 5 % Kontamination aufwiesen. Diese Genome wurden mit GTDB-tk Version 1.5.1 und Release 202 der GTDB-Datenbank39 klassifiziert. Das verkettete Alignment von GTDB-tk wurde verwendet, um einen phylogenetischen Baum unter Verwendung von IQ TREE Version 1.6.1240 mit 100 Bootstraps zu generieren, und der Modellparameter m wurde auf TESTNEW gesetzt.
Genom-Bins wurden durch kofamscan Version 1.2.0 und durch Blastp in BLAST Version 2.11.0+ anhand einer Datenbank von Proteinsequenzen im Zusammenhang mit dem extrazellulären Elektronentransfer, insbesondere OmcS, MtrC, MtrF, OmcA, PioA und PilA, funktionell charakterisiert (siehe ergänzender Datensatz 1). für Zugangsnummern)41,42. Kofamscan-Treffer wurden als Übereinstimmungen betrachtet, wenn der niedrigste E-Wert mit dem Abfragemodell übereinstimmte und unter 1E−6 lag. Module oder Kategorien, bei denen weniger als 10 % der übereinstimmenden Proteine als nicht vorhanden galten, 10–70 % als teilweise vorhanden und 70–100 % als vollständig vorhanden. BLAST-Übereinstimmungen wurden als Treffer mit >30 % Sequenzidentität über 70 % der Länge der Abfragesequenz betrachtet. Eine einzelne positive BLAST-Übereinstimmung für ein EET-bezogenes Gen (siehe Ergänzungsdatensatz 1) wurde als vollständige Übereinstimmung gewertet. Dissimilatorische Sulfitreduktase (DsrAB)-Proteine wurden anhand des besten BLAST-Treffers in einer DsrAB-Datenbank als oxidativ oder reduktiv eingestuft43. Diese kombinierten Kofamscan- und BLAST-Methoden wurden verwendet, um die in Abb. 3 gezeigten Merkmale zu bestimmen. Die Bestimmung der Sulfidoxidation basierte auf dem Vorhandensein/Fehlen von Genen, die für Reverse DsrAB oder das Sox-System kodieren. Die Sulfatreduktion basierte auf der Anwesenheit von dsrAB43. Die aerobe Atmung basierte auf dem Vorhandensein mindestens eines Satzes von Genen, die für eine Cytochrom-C-Oxidase kodieren. Die Nitrat-/Nitrit-Atmung basierte auf dem Vorhandensein von Genen, die für eine von mehreren Nitrat- oder Nitrit-Reduktasen kodierten. Autotrophie wurde durch das Vorhandensein von acsAB (was auf den Wood-Ljungdahl-Weg hinweist), cbbLS (was auf den Calvin-Zyklus hinweist) oder nifJ/porCDAB/oorDABC (was auf den umgekehrten Zitronensäurezyklus hinweist) angezeigt. Weitere Wege und Gene für Chemotaxis, Flagellenaufbau, Glykolyse und aeroben Methan- oder Formiatstoffwechsel wurden ebenfalls untersucht, sind jedoch nicht in Abb. 3 enthalten. Alle Einzelheiten zu den für diese Gene und Wege gescreenten Zugangsnummern sind in der Kopfzeile des Ergänzungsdatensatzes 1 enthalten.
Die relativen Genom-Bin-Mengen wurden erhalten, indem getrimmte Lesevorgänge mithilfe von BBMap einer Datenbank aller gruppierten Contigs zugeordnet wurden, wobei die Abdeckung (durchschnittliche Faltung) für jeden Contig der „covstats“-Ausgabe des Programms entnommen wurde. Anschließend wurde ein gewichteter Mittelwert für die Abdeckung jedes Genom-Bins berechnet, wobei der durchschnittliche Faltwert für jeden Contig basierend auf der Länge des Contigs gewichtet wurde.
Um einen phylogenetischen Überblick über die im Metagenom sequenzierten Mikroorganismen zu erhalten, wurden alle getrimmten Lesevorgänge mit der SILVA-rRNA-Datenbank für kleine Untereinheiten, Version 138.144, abgeglichen. Diese Lesevorgänge wurden dann von der SILVAngs-Pipeline Version 1.4.6 (ebenfalls unter Verwendung von SILVA Version 138.144) geclustert und taxonomisch klassifiziert.
Acidovorax facilis DSM 649 wurde vor der Verwendung etwa 1–2 Wochen lang in Nährbrühe (Merck) bei 30 °C gezüchtet. Einige Tropfen der A. facilis-Kultur, die unter oxischen Bedingungen vorgezüchtet und dann 10 Minuten lang mit N2 gespült wurde, wurden während des Zusammenbaus anstelle des anoxischen Leitungswassers in Objektträgerkammern aus Glas gegeben. Die Objektträger wurden 12–24 Stunden lang in Feuchtigkeitskammern bei 16 °C aufbewahrt, sodass Kabelbakterien Zeit hatten, vom Sediment zum Rand der Objektträger zu gelangen. A. facilis-Zellen wurden dann wie unten beschrieben mittels Raman-Mikroskopie analysiert.
Nitrospina gracilis wurde auf einem Meeresmineralmedium auf der Basis von Salz aus dem Roten Meer mit Vitaminzusätzen und 2 mM NO2− bei 28 °C im Dunkeln ohne Rühren kultiviert45.
DNA wurde aus Acidovorax facilis DSM 649 mit dem DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit (Qiagen) extrahiert, eine Illumina-Bibliothek wurde mit dem Nextera XT-Kit (Illumina) erstellt und das gesamte Genom wurde auf einem Illumina MiSeq sequenziert (siehe Lustermans et al.46 für). Einzelheiten). Die Sequenzqualität wurde mit FastQC36 vor dem Trimmen mit Trimmomatic37 und dem Zusammenfügen mit SPAdes47 bewertet. Das Genom wurde beim NCBI eingereicht und ist unter der Zugangsnummer PRJNA849392 verfügbar.
Die durchschnittliche Nukleotididentität zwischen dem Genom von DSM 649 und dem Genom bin GS.4 wurde mit dem Online-ANI-Rechner (http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/) nach der Methodik von Goris et al.48 bestimmt .
Die Spektren wurden mit einem konfokalen LabRAM HR Evolution Raman-Mikroskop (HORIBA) aufgezeichnet, das mit einem 500 mW, 532 nm Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat-Laser, einem 1064 nm-Laser für optische Pinzetten, einem Andor EM CCD-Detektor, der auf Emissionen von 500–650 nm eingestellt ist, ausgestattet war. Gitter 300 mit einer spektralen Auflösung von 2,8 cm−1, einer Lochblende auf 300 µm und einem Wasserobjektiv mit 60-facher Vergrößerung. Die Laserintensität wurde für native Beflockungszellen auf 25 % Maximalleistung und für eingeführte A. facilis-Zellen auf 10 % eingestellt, mit einer Erfassungszeit von 5–10 s pro Messung. Native Beflockungszellen mit mehr angesammeltem Material wurden mit höheren Laserintensitäten gemessen, um ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Zellen mit zwei Morphologien, kleine Stäbchen (0,5–1 µm) und eiförmige Zellen (0,5–1,5 µm), wurden in einem Abstand von 50 µm zu einem Kabelbakterium mit Bakterienbeflockung mithilfe der Laserpinzette eingefangen. Jede eingefangene Zelle wurde direkt neben das Kabelbakterium bewegt und gemessen, dann in einen Bereich ohne Zellbeflockung, 50–100 µm vom Kabelbakterium entfernt, bewegt und erneut gemessen, um Intensitätsunterschiede in der 750-cm-1-Bande18 zwischen den zu erkennen zwei Messungen. Aufgrund der Ansammlung um das Kabelbakterium wurden Zellen oft von anderen Zellen aus der Laserfalle geworfen, und aus diesem Grund wurde an beiden Positionen nur ein einziges Spektrum aufgenommen. Alle gepaarten Messungen, die unvollständig waren oder aufgrund verlorener Zellen, des Einschlusses zusätzlicher Zellen oder aufgrund der Bewegung von Kabelbakterien möglicherweise beeinträchtigt waren, wurden entfernt. Da das Licht während Raman-Messungen ausgeschaltet werden musste, was zu einer kurzen Zeitspanne führte, in der die gefangene Zelle aus der Falle geworfen werden konnte, wurden gepaarte Spektren nur dann gespeichert, wenn sie innerhalb des Paares ähnlich waren, ohne größere Verschiebungen im C– H-Bereich der Spektren (2800–3000 cm−1). Raman-Spektren von A. facilis-Zellen wurden für lasergefangene Einzel-, Doppel- oder Clusterzellen aufgezeichnet. Um die Messungen zu vergleichen, wurde die Bandenintensität bei 750 cm–1 normalisiert, indem der Median der Grundlinie von 735 auf 740 cm–1 und von 760 auf 765 cm–1 subtrahiert wurde.
Die Wirkung des Einfangens und Bewegens von Zellen durch Laser auf das Raman-Signal wurde unter Verwendung einer Reinkultur von Nitrospina gracilis unter oxischen und anoxischen Bedingungen untersucht. Für die anoxische Behandlung wurde ein Aliquot von aktiv nitrifizierendem N. gracilis 1:5 in frischem Medium verdünnt und in Hungate-Röhrchen überführt. Anschließend wurden die Röhrchen 10 Minuten lang mit N2 gespült und eine Teilprobe in dieselbe Mikroskopiekammer gegeben, die in den vorherigen Experimenten verwendet wurde. Einzelne Zellen wurden mit einer optischen Pinzette eingefangen, gemessen und 50–100 µm bewegt, bevor erneut gemessen wurde, um Datenpaare für jede Zelle zu erzeugen. Raman-Messungen wurden wie oben beschrieben mit 10 % Laserintensität und einer Erfassungszeit von 10 s durchgeführt. Die Messungen wurden in der Mitte der Kammer durchgeführt, um die Sauerstoffkontamination zu minimieren. Die gepaarten Daten wurden wie zuvor beschrieben behandelt.
Quantitative Daten aus Zellverfolgung, Hybridisierung und Raman-Mikroskopie wurden in R analysiert. Für Zellverfolgung und Hybridisierungszählungen wurde der Welch-T-Test mit zwei Stichproben verwendet. Für die Raman-Mikroskopie wurde ein Student-T-Test für abhängige Proben verwendet.
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.
Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt. Die in dieser Studie generierten Mikroskopiedaten wurden in der Zenodo-Datenbank [https://doi.org/10.5281/zenodo.7593818] hinterlegt. Metagenomische Daten (Rohdaten und die 27 vom Metagenom abgeleiteten Genome) wurden in der NCBI-Datenbank unter der Zugangsnummer PRJNA730231 hinterlegt. Das Genom von Acidovorax facilis DSM 649 wurde in der NCBI-Datenbank unter der Zugangsnummer PRJNA849392 hinterlegt.
Der für die Analyse der in dieser Studie generierten Mikroskopiedaten verwendete R-Code wurde zusammen mit den Mikroskopiedaten in der Zenodo-Datenbank hinterlegt, ebenso wie der Code zur Bestimmung des Signalweginhalts der vom Metagenom abgeleiteten Genome.
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Lars B. Pedersen für die sorgfältige Konstruktion von Mikrosensoren; Britta Poulsen, Susanne Nielsen, Anne Stentebjerg und Lykke Poulsen für hervorragende technische Unterstützung in den Molekularlaboren. Diese Forschung wurde von der Dänischen Nationalen Forschungsstiftung (Center of Excellence DNRF104 und DNRF136), der Carlsberg Foundation (CF19-0666 und CF21-0409 an JJB) und dem Europäischen Forschungsrat (ERC Advanced Grant 291650 an LPN) finanziert. MW wurde durch den Wittgenstein-Preis des Österreichischen Wissenschaftsfonds FWF (Z-383B) gefördert.
Zentrum für Elektromikrobiologie (CEM), Abteilung für Mikrobiologie, Fachbereich Biologie, Universität Aarhus, Aarhus C, Dänemark
Jesper J. Bjerg, Jamie JM Lustermans, Ian PG Marshall, Signe Brokjær, Casper A. Thorup, Lars Peter Nielsen und Andreas Schramm
Exzellenzzentrum für mikrobielle Systemtechnologie, Universität Antwerpen, Wilrijk, Belgien
Jesper J. Bjerg
Zentrum für Mikrobiologie und Umweltsystemwissenschaften, Abteilung für Mikrobielle Ökologie (DOME), Universität Wien, Wien, Österreich
Anna J. Müller, Markus Schmid & Michael Wagner
Doktoratsschule für Mikrobiologie und Umweltwissenschaften, Universität Wien, Wien, Österreich
Anna J. Müller
Bioinformatik-Forschungszentrum (BiRC), Universität Aarhus, Aarhus C, Dänemark
Paula Tataru
Zentrum für mikrobielle Gemeinschaften, Abteilung für Chemie und Biowissenschaften, Universität Aalborg, Aalborg, Dänemark
Michael Wagner
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JJB entdeckte das Flocking-Phänomen; JJB, LPN, MW und AS haben die Experimente entworfen; JJB führte Beflockungsbeobachtungen und Schnittexperimente durch; SB und AS führten FISH durch; JJML, MS, AJM und JJB führten Raman-Mikroskopie durch; IPGM und CAT führten eine Sequenzanalyse durch; JJB, LPN und PT führten Bildanalysen und Datenanalysen durch; JJB, LPN und AS haben den Artikel mit Beiträgen aller Autoren verfasst.
Korrespondenz mit Jesper J. Bjerg oder Andreas Schramm.
Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Nature Communications dankt Annette Rowe, Diana Vasquez-Cardenas, Navish Wadhwa und Rui Zhao für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.
Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Bjerg, JJ, Lustermans, JJM, Marshall, IPG et al. Kabelbakterien mit elektrischer Verbindung zu Sauerstoff ziehen Schwärme verschiedener Bakterien an. Nat Commun 14, 1614 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37272-8
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Eingegangen: 07. April 2022
Angenommen: 08. März 2023
Veröffentlicht: 23. März 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37272-8
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